こんなんでどう？

        Dim dt1 As Date = Nothing
        Dim dt2 As Date = Nothing

        Date.TryParseExact(TextBox1.Text, "HH:mm:ss", CultureInfo.InvariantCulture, Globalization.DateTimeStyles.None, dt1)
        Date.TryParseExact(TextBox2.Text, "HH:mm:ss", CultureInfo.InvariantCulture, Globalization.DateTimeStyles.None, dt2)

        If dt1 <> Nothing AndAlso dt2 <> Nothing Then
            Dim df = dt2.Subtract(dt1)
            TextBox3.Text = String.Format("{0:00}:{1:00}:{2:00}", df.Hours, df.Minutes, df.Seconds)
        End If