> AddHandler item(i).MouseClick, AddressOf Item_Click

MouseClick を使っているのは、意図的なものでしょうか。
CheckedChanged を使わないと、キーボードからの選択時に問題がありませんか?
（矢印キー等でカーソル移動して、Space キーで選択された場合など)


> item(i) = new checkbox　<--- 意外な感じですが checkbox を使っています

上記の配列が

Private item() As CheckBox

で管理されているのなら、Tag プロパティに頼らずとも

Dim idx As Integer = Array.IndexOf(item, sender)

'Dim chk As CheckBox = item(idx) 

'Dim chk As CheckBox = DirectCast(sender, CheckBox) 

で処理できそうです。